Ігх дослідження - помічник в розшифровці біології раку молочної залози

Незважаючи на те, що все більше в клініках починають використовуватися методи генетичного фенотипування пухлин, ІГХ дослідження залишається на сьогодні основним помічником в розшифровки біології раку молочної залози, в прогнозуванні його подальшого розвитку, "провісником" відповіді пухлини на заплановане лікування.

У цій статті ви дізнаєтеся: що таке иммуногистохимическое (ІГХ) дослідження, яке значення ІГХ має при раку молочної залози.

Гистохимія (фарбування зрізів в гістології)

Перед тим, як патологоанатом (морфолог) почне розглядати під мікроскопом ділянку тканини молочної залози, отриманий в внаслідок біопсії, йому необхідно його забарвити спеціальними барвниками.

Гистохимические барвники наносять на тонкий зріз ділянки тканини, щоб розглянути під мікроскопом, які клітини там присутні, їх розташування по відношенню один до одного (структуру тканини). Світлова мікроскопія є рутинним методом вивчення забарвлених зрізів тканини, широко використовується в діагностиці раку молочної залози. Найбільш часто для фарбування зрізів тканини використовують:

• Гематоксилін - забарвлює клітинне ядро в темно-синій колір;
• Еозином - робить цитоплазму клітин рожевої. Спільне їх використання називається гематоксилин-еозіновое фарбування.

Що таке імуногістохімія (ІГХ)

Патологоанатом - це лікар, який довго вчився в медичному університеті, щоб знати, як за допомогою мікроскопа відрізнити в пофарбованому зрізі тканини ракові клітини від нормальних. Зазвичай для постановки діагнозу (доброякісна це патологія або злоякісна) йому досить розглянути під мікроскопом зріз тканини, забарвлений гематоксиліном і еозином. Але іноді цього буває недостатньо. У такій ситуації на допомогу приходить імуногістохімія, яка до морфологічної ідентифікації клітин і тканин додає імунологічний компонент.

Методика імуногістохімії (ІГХ) доповнює морфологічний розпізнавання клітин і тканин, використовуючи антитіла до відомим антигенів, які є специфічними для певних типів клітин або клітинних компонентів. Розташування цих антитіл можна побачити, використовуючи світлову мікроскопію, так як антитіла містять зорово-розпізнаються мітки.

Перші методики імуногістохімічного аналізу раку молочної залози використовували антитіла з прикріпленими до них флуоресціюючими мітками, що вимагало застосування спеціального флуоресцентного мікроскопа, що дозволяє побачити локалізацію цих антитіл в зрізі тканини молочної залози.

За останні 30 років вдалося суттєво спростити методику, яка застосовується при ІГХ дослідженні молочної залози, за рахунок використання більш специфічних антитіл (моноклональних антитіл) з ферментативними мітками. Це, в свою чергу, дозволило при іммуногістологіческоеультраструктурному дослідженнях молочної залози використовувати світлову мікроскопію, яка набагато дешевше, і тому найбільш доступна. Однак радіоактивні елементи (пероксидаза, лужна фосфатаза і флуоресцеїну), без яких інколи не обійтися, вимагають спеціальних методик і до сих пір широко використовуються.

Необхідність використання імуногістохімії при раку молочної залози, контроль її якості і інтерпретація отриманих результатів повинні контролюватися патоморфологічні відділенням. Важливо, щоб розшифровка отриманих даних при ІГХ дослідженні використовувалася тільки в поєднанні з морфологічним аналізом тканин молочної залози, отриманим в результаті фарбування їх гематоксиліном і еозином.

Сьогодні імуногістохімічне дослідження при раку молочної залози є рутинним методом в більшості морфологічних (патогістологічних) лабораторіях і використовується для уточнення діагнозу, а також з прогностичної метою, як предикативного (пророкує) покажчика, як поведе себе рак молочної залози в подальшому.

Діагностика раку грудей і ІГХ

Коли патологоанатом розглядає під мікроскопом біопсійний матеріал, перед ним стоїть дві основні діагностичні завдання: визначити походження пухлинних клітин, де вони з`явилися (в протоках, в часточках або в інших ділянках молочної залози) і підтвердити або виключити їх вторгнення в довколишні тканини.

Діагностичні ІГХ маркери, що застосовуються при раку грудей

З перших днів використання ІГХ в онкології вівся пошук нових і удосконалювалися вже існуючі технології застосування антитіл, які могли б ідентифікувати антигени клітин з високим ступенем специфічності і чутливості. Перераховані нижче ІГХ маркери в даний час широко використовуються для уточнення гістопатологічного діагнозу раку молочної залози:

цитокератини

• CK5, CK10, CK14 і CK17 є цитокератини базального шару епітелію, експресуються міоепітеліальние клітинами.
• CK5 / 6 або "базальні цитокератини» допомагають розпізнати нормальні клітини молочної залози як міоепітеліальние, так і ламінарні (секретуючі).
• 34 12: це антитіло допомагає розпізнати цитокератини 1, 5, 10 і 14.

Маркери гладких м`язів

• Н-caldesmon. Його можна знайти тільки в міоепітеліальних клітинах молочних проток, тому він має високу специфічність.
• Гладком`язових актин (SMA). Це антитіло допомагає виявити актин в мікрофіламентах- низька специфічність, так як SMA виявляється в фібробластах (в тканинах, які регенерують).
• Міозин важких ланцюгів гладких м`язів (SMMHC) - Структурний компонент міозину гладеньких м`язів в SM2 ізоформах. Експресується міоепітеліальние клітинами молочної залози, має високу чутливість і специфічність, так як SMMHC присутній тільки в міоепітеліальних клітинах, розташованих в протоках і часточках молочної залози, але відсутня в фібробластах сполучної тканини залози.
• Calponin - Поліпептид, 34 кДа, модулює активність актомиозина. Хороша чутливість, але присутній в фібробластах сполучної тканини молочної залози.
• P63-p53 гомолог - ядерний маркер, вельми чутливий до міоепітеліальние клітинам.
• CALLA: Ендопептід, який експресується в міоепітеліальних клітинах.
• P-cadherin - молекула клітинної адгезії з високою чутливістю до міоепітеліальние клітинам нормальної тканини молочної залози. Чи не вступає в реакцію з фібробластами.

інші маркери

• Е-кадгерінов - молекула клітинної адгезії. Використовується, щоб відрізнити протоковую карциному "in suti" (DCIS) від дольковой. Карциноми "in suti" (LCIS) - DCIS, як правило, виявляються по фарбуванню мембрани, на відміну від LCIS, при якій її немає.
• маркери меланоми: S100, Melan-A, HMB45.
• маркери лімфоцитів: CD20, LCA, CD15, CD30.
• Маркери ендотелію судин: CD31, CD34, фактор VIII, d2-40 (podoplanin).
• Маркери клітинної проліферації: Ki67, MIB-1, PPh3.
• маркери апоптозу: Bcl-2 і Вах, Bcl-X.

Приклади використання ІГХ для вирішення проблем, що виникли при визначенні патології молочної залози

Існує багато ситуацій, коли імуногістохімія сприяє постановці заключного патогістологічного діагнозу при патології молочних залоз:

• Фарбування e-кадгерінов клітинної мембрани дозволяє виключити дольковий неоплазии (ALH) і LCIS. Відсутність фарбування клітинної мембрани говорить на користь часточкових пухлин.
• Звичайна гіперплазія епітелію, або це епітеліальна атипия, або це DCIS. При доброякісної гіперплазії можна виявити реактивність до CK5 / 6 і CK14, тоді як при атипові гіперплазії і DCIS її немає.

Це мікро-інвазивна карцинома або щось інше? Застосування маркерів міоепітеліальних клітин має значення при оцінці, присутній чи ні мікро-інвазія карциноми (вторгнення з ламінарного шару в міоепітеліальние шар клітин). Реактивність фібробластів, розрив у фарбуванні клітин, фарбування міоепітеліальних клітин гладких м`язів судин можуть викликати труднощі в інтерпретації спостерігається картини під мікроскопом. У цій ситуації використовуються два маркера міоепітеліальних клітин, наприклад, p63 і SMMHC, або ASMA, або calponin.

Які ІГХ маркери використовуються в діагностичних панелях при патології молочних залоз

Набір маркерів (діагностична панель), який використовується в ІГХ дослідженнях при раку молочної залози, багато в чому залежить від оснащеності лабораторії, в якій проводиться імуногістохімія, і досвіду лікаря, що проводить її. Нижче наведено кілька порад, які ІГХ панелі необхідно застосовувати при патології молочних залоз, надані одній з клінік:

• Міозин важких ланцюгів гладких м`язів (SMMHC) або calponin - маркери чутливі та специфічні до цитоплазми міоепітеліальних клітин;
• Актин гладких м`язів може бути використаний, але все одно в інтерпретації слід враховувати, що він присутній в фібробластах (запалення і рубець);
• P63 є чутливим і специфічним маркером до ядер міоепітеліальних клітин, але фарбування може бути переривчастим. Застосування маркера до цитоплазми міоепітеліальних клітин, таких як SMMHC або calponin, слід використовувати, щоб не виникли проблеми в інтерпретації отриманої картини.

При спробі визначити наявність або відсутність міоепітеліальних клітин слід використовувати p63 і SMMHC, або calponin.

Роль імуногістохімії у визначенні "прогностичних" і "Інтелектуальне" чинників при раку молочної залози

Прогностичні фактори надають інформацію про можливу поведінку раку молочної залози на момент його діагностики і не залежать від терапії. Тобто за допомогою них можна судити, як буде швидко прогресувати рак і, відповідно, в залежності від цього прийняти рішення, який обсяг і лікування кращі в кожній конкретній ситуації.

У свою чергу, "Інтелектуальне" (пророкують) фактори забезпечують інформацією, яка дозволяє судити про ймовірність відповіді пухлини на конкретну терапію. Незважаючи на те, що прогностичні і Інтелектуальне чинники можна класифікувати окремо, в діагностиці та класифікації раку молочної залози частіше вони є як прогностичними, так і Інтелектуальне.

Наприклад, наявність високої експресії HER2. Якщо рак молочної залози her2 позитивний (велика кількість в пухлини білка HER2), то він протікає агресивно, з раннім метастазуванням у віддалені органи. А якщо пухлина містить малу кількість цього білка (рак молочної залози her2 негативний), вона не буде реагувати на застосування таргетних препарату Герцептин.

"Базальні" ІГХ маркери

існує підрозділ раку молочної залози в залежності то того, які гени експресують його клітини (профіль експресії генів). Пухлини, профіль яких характерний для базальних або міоепітеліальних клітин нормальної молочної залози, будуть показувати наявність «базальних» маркерів. Такі пухлини мають несприятливий прогноз. У більшості з цих «базальних» пухлин повністю відсутні ER, PR (рецептори до естрогену і прогестерону) і білок HER2. Вони часто метастазують в головний мозок, в легені.

На сьогодні немає консенсусу з імуногістохімічними профілем (які ІГХ маркери повинні застосовуватися), який би чітко визначав ці «базальні» раки. До цих пухлин з поганим прогнозом відноситься і так званий «тричі негативний рак молочної залози», в якому відсутні ER, PR і HER2, але експрессируются базальні цитокератини 5/6 і 14, рецептор епідермального фактора росту (EGFR) і C-KIT. Вони можуть також експресувати P-кадгерінов і часто p63.

Є подібність між «базальним» раком молочної залози і раками, які виявляються у жінок з BRCA1 мутацією.

EGFR експресується часто в «базальних» раках, тому пацієнтки з такими пухлинами можуть отримати користь при лікуванні інгібіторами EGFR.

ІГХ маркери проліферації (швидкості росту пухлини)

Кількість мітозів або відсоток клітин, що знаходяться в мітозі, давно вважається морфологічним «биомаркером» прогнозу раку. Існує ряд ІГХ маркерів, які демонструють активність клітин (кількість мітозів):

• Ki67 - антиген, який експресується в ядрах клітин на всіх етапах клітинного циклу і є корисним маркером клітинної проліферації;
• MIB1 - антитіло, яке реагує з Ki-67 в тканини, зафіксованої формаліном або парафіном;
• PPh3.

ІГХ маркери апоптозу

Апоптоз або «запрограмований суїцид клітини» є биомаркером агресивних пухлин. Білки апоптозу можна ідентифікувати за допомогою ІГХ:

• Bcl-2;
• Вах;
• Bcl-X.

Інші "прогностичні" маркери

• р53. Мутації в гені р53 супрессора пухлин (TP53) виявляються в 20-30% випадках раку молочної залози. Ці генні мутації спостерігаються частіше у жінок зі спадковими синдромами раку молочної залози, ніж у жінок з спорадичним раком. Для пацієнтки з генетичною схильністю до раку молочної залози може бути рекомендовано р53-тестування. Виявлення мутацій в р53 також розглядається в якості можливого провісника відповіді раку молочної залози на хіміотерапію, але виявлення білка р53 імуногістохімічно в пухлини не відображає статус мутації р53.
• Топоізомераза II альфа. Це мішень, на яку спрямована дія антрацикліну - хіміотерапевтичного препарату, який часто використовується в лікування раку молочної залози.