Плр (полімеразна ланцюгова реакція). Як проводиться плр діагностика, показання, як підготуватися до дослідження, результат плр

Для адекватного та ефективного лікування багатьох інфекційних захворювань необхідно своєчасне встановлення точного діагнозу. У вирішенні цього завдання в наші дні залучаються високотехнологічні методи діагностики засновані на методах молекулярної біології. В теперішню мить  полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) вже досить широко застосовується в практичній медицині як найбільш надійний інструмент лабораторної діагностики.

Чим пояснюється популярність ПЛР в даний час?

По-перше, даний метод використовується для виявлення збудників різних інфекційних захворювань з високою точністю.

По-друге, для контролю ефективності проведеного лікування.

У різних довідниках, проспектах, статтях, а також поясненнях лікарів-фахівців, ми часто стикаємося з вживанням незрозумілих термінів і слів. Дійсно важко розповісти про високотехнологічних продуктах науки буденними словами.

У чому суть і механіка ПЛР діагностики?

Кожен живий організм має свої унікальні гени. Гени розташовуються в молекулі ДНК, яка власне і є «візитною карткою» кожного конкретного організму. ДНК (генетичний матеріал) - це дуже довга молекула, яка складається з «цеглинок», званих нуклеотидами. У кожного збудника інфекційних захворювань вони розташовані строго специфічно, тобто в певній послідовності і комбінації. Коли необхідно зрозуміти чи є у людини той чи інший збудник, забирається біологічний матеріал (кров, сеча, слина, мазок), який містить ДНК або фрагменти ДНК мікроба. Але кількість генетичного матеріалу збудника дуже мало, і неможливо сказати якого саме мікроорганізму він належать. Для вирішення цього завдання і служить ПЛР. Суть полімеразної ланцюгової реакції полягає в тому, що береться мала кількість матеріалу для дослідження, що містить ДНК, а в процесі ПЛР відбувається збільшення кількості генетичного матеріалу, що належить конкретному збудника і, таким чином, його можна ідентифікувати.

ПЛР діагностика - генетичне дослідження біоматеріалу.

Ідея методу ПЛР належить американському вченому K.Mullins, яку він запропонував у 1983 році. Однак широке клінічне застосування отримала лише в середині 90-х років XXвека.

Розберемося з термінологією, що ж це таке - ДНК і т.д. Кожна клітина будь-якого живої істоти (тварини, рослини, людини, бактерії, вірусу) має хромосоми. Хромосоми - це хранителі генетичної інформації, які містять всю послідовність генів кожного конкретного живої істоти.

Кожна хромосома складається з двох ниток ДНК, закручених у спіраль один щодо одного. ДНК - хімічно це дезоксирибонуклеїнова кислота, яка складається з структурних компонентів - нуклеотидів. Нуклеотидів буває 5 видів - тимін (Т), аденозин (А), гуанін (Г), цитозин (Ц) і урацил (У). Нуклеотиди розташовуються один за одним в строгій індивідуальної послідовності, утворюючи гени. Один ген може складатися з 20-200 таких нуклеотидів. Наприклад, ген, що кодує вироблення інсуліну, складається з 60 пар нуклеотидів.

Нуклеотиди мають властивість комплементарності. Це означає що навпроти аденіну (А) в одному ланцюжку ДНК обов`язково варто тимін (Т) в інший ланцюжку, а навпаки гуаніну (Г) - цитозин (Ц). Схематично виглядає наступним чином:
Г - Ц
Т - А
А - Т
Дана властивість комплементарності ключове для проведення ПЛР.

Крім ДНК таку ж структуру має РНК - рибонуклеїнова кислота, що відрізняється від ДНК тим, що замість тиміну в ній використовується урацил. РНК - є хранителем генетичної інформації у деяких вірусів, які називаються ретровирусами (наприклад, ВІЛ).

       Молекули ДНК і РНК можуть «розмножуватися» (ця властивість використовується для проведення ПЛР). Відбувається це таким чином: дві нитки ДНК або РНК, відходять один від одного в сторони, на кожну нитку сідає спеціальний фермент, який синтезує створення нового обговорення. Синтез йде за принципом комплементарності, тобто, якщо у вихідній ланцюжку ДНК варто нуклеотид А, то у знову синтезованої стоятиме Т, якщо Р - то Ц і т.д. цей спеціальний фермент-«Будівельник» для початку синтезу потребує «затравки» - послідовності з 5-15 нуклеотидів. Дана «запал» визначена для кожного гена (гена хламідії, мікоплазми, вірусів) Експериментально.

Отже, кожен цикл ПЛР складається з трьох стадій. В першу стадію відбувається так зване розкручування ДНК - тобто поділ пов`язаних між собою двох ланцюгів ДНК. До другої - відбувається приєднання «затравки» до ділянки нитки ДНК. І, нарешті, подовження даних ниток ДНК, яке проводиться ферментом- «будівельником». В даний час весь цей складний процес протікає в одній пробірці і складається з повторюваних циклів розмноження визначається ДНК з метою отримання великої кількості копій, які можуть бути, потім виявлені звичайними методами. Тобто з однієї нитки ДНК ми отримуємо сотні або тисячі.

Етапи проведення ПЛР дослідження

Забір біологічного матеріалу для дослідження

Як пробу служить різний біологічний матеріал: кров і її компоненти, сеча, слина, виділення слизових оболонок, спинномозкова рідина, виділення ранових поверхонь, вміст порожнин тіла. Все біопроб збираються одноразовими інструментами, а набраний матеріал укладають в пластикові стерильні пробірки або поміщають на культуральні середовища, з подальшим транспортуванням в лабораторію.

У забрані проби додають необхідні реагенти і ставлять в програмований термостат - термоциклер (ампліфікатор). У ампліфікаторі 30-50 разів повторюється цикл ПЛР, що складається з трьох етапів (денатурація, отжиг і подовження). Що це означає? Розглянемо докладніше.

Етапи непостредственно ПЛР реакції, копіювання генетичного матеріалу

I етап ПЛР - Підготовка генетичного матеріалу для копіювання.
Відбувається при температурі 95 ° С, при цьому нитки ДНК роз`єднуються, і на них можуть сідати «затравки».

«Затравки» виготовляють промисловим способом різні науково-виробничі об`єднання, а лабораторії купують вже готові. При цьому «запал» для виявлення, наприклад, хламідії, працює тільки для хламідії і т.д. Таким чином, якщо тестується біоматеріал на наявність хламідійної інфекції, то в реакційну суміш поміщається «запал» для хламідій- якщо тестування біоматеріалу на вірус Епштейн-Барра, то і «запал» для вірусу Епштейн-Барра.

II етап - Об`єднання генетичного матеріалу збудника інфекції і «затравки».
Якщо є ДНК визначається вірусу або бактерії, «Запал» сідає на цю ДНК. Цей процес приєднання «затравки» і є другий етап ПЛР. Дана стадія проходить при температурі 75 ° С.

III етап - Копіювання генетичного матеріалу збудника інфекції.
Це процес власне подовження або розмноження генетичного матеріалу, який відбувається при 72 ° С. До «затравки» підходить фермент «будівельник» і синтезує нову ланцюжок ДНК. Із закінченням синтезу нового ланцюжка ДНК, закінчується і цикл ПЛР. Тобто за один цикл ПЛР відбувається збільшення кількості генетичного матеріалу в два рази. Наприклад, у вихідній пробі було 100 молекул ДНК будь-якого вірусу, після першого циклу ПЛР в пробі буде вже 200 молекул ДНК тестованого вірусу. Один цикл триває 2-3 хвилини.

Для освіти достатньої кількості генетичного матеріалу для ідентифікації, зазвичай проводиться 30-50 циклів ПЛР, що займає 2-3 години.

Етап ідентифікації розмноженого генетичного матеріалу

Власне ПЛР на цьому закінчується і далі йде не менш значимий етап ідентифікації. Для ідентифікації використовують метод електрофорезу або мічені «затравки». При використанні електрофорезу отримані нитки ДНК поділяються за розмірами, і наявність фрагментів ДНК різної довжини свідчить про позитивний результат аналізу (тобто про наявність того чи іншого вірусу, бактерії і т.д.). При використанні мічених «запалів», до кінцевого продукту реакції додають хромоген (барвник), внаслідок чого ферментативна реакція супроводжується утворенням забарвлення. Розвиток забарвлення прямо свідчить, що вірус або інший виявляється агент присутні у вихідній пробі.

На сьогоднішній день, використовуючи мічені «затравки», а також відповідне програмне забезпечення, можна робити відразу і «читання» результатів ПЛР. Це так називаемаяreal-time ПЛР.

Чому ПЛР діагностика має таку цінністю?

Одним з істотних переваг методу ПЛР є висока чутливість - від 95 до 100%. Однак, ці переваги мають базуватися на неодмінному дотриманні наступних умов:

1. коректний паркан, транспортування біологічного матеріалу;
2. наявність стерильного, одноразового інструментарію, спеціальних лабораторій і навченого персоналу;
3. суворе дотримання методики і стерильності під час проведення аналізу

Чутливість різниться для різних виявляються мікробів. Так, наприклад, чутливість методу ПЛР для виявлення вірусу гепатиту З становить 97-98%, чутливість для виявлення уреаплазми - 99-100%.

Можливості, закладені в ПЛР-аналізі, дозволяють досягти неперевершеної аналітичної специфічності. Це означає виявлення саме того мікроорганізму, який шукали, а не схожого або близькоспорідненого.
Діагностична чутливість та специфічність методу ПЛР, часто перевершують такі і для культурального методу, званого «золотим стандартом» для виявлення інфекційних захворювань. З огляду на тривалість вирощування культури (від декількох днів до декількох тижнів), перевага методу ПЛР стає очевидним.

ПЛР в діагностиці інфекцій
Переваги методу ПЛР (чутливість і специфічність) визначають широкий спектр застосування в сучасній медицині.
Основні області застосування ПЛР-діагностики:

1. діагностика гострих та хронічних інфекційних захворювань різної локалізації
2. контроль ефективності проведеної терапії
3. уточнення виду збудника

ПЛР використовується в акушерстві, гінекології, неонатології, педіатрії, урології, венерології, нефрології, клініці інфекційних хвороб, офтальмології, неврології, фтизиопульмонологии і ін.

Використання ПЛР-діагностики проводиться в сукупності з іншими методами дослідження (ІФА, ПІФ, РІФ та ін.). Їх поєднання і доцільність визначає лікуючий лікар.

Збудники інфекцій, які виявляються методом ПЛР

віруси:

1. ретровіруси HIV-1 і HIV-2
2. герпетиформний віруси
3. вірус простого герпесу 1 і 2 типів
4. цитомегаловірус
5. вірус Епштейна-Барр
6. варицелла - Зостер вірус
7. герпес віруси людини 6 і 7
8. вірус гепатиту С, В і А
9. віруси папіломи людини
10. вірус краснухи
11. аденовіруси
12. риновіруси
13. парвовіруси
14. пікорновіруси

бактерії:

1. мікобактерії
2. хламідії
3. мікоплазми
4. сальмонела
5. легионелли
6. клостридії
7. бліда трепонема
8. різні патогенні види кишкової палички
9. холерний вібріон
10. рикетсії
11. золотистий стафілокок
12.  бактеріальний збудник менінгіту
13. хелікобактер пілорі
14. уреаплазма
15. збудник гонореї
16. дифтерійна паличка
17. гемофільна паличка

В даному списку наведені найбільш поширені інфекційні агенти, які виявляються методом ПЛР. Насправді даний список набагато ширше, постійно поповнюється, так як синтезуються нові «затравки». Також слід зазначити, що список визначених збудників визначається наявністю «запалів» для ідентифікації в арсеналі кожної конкретної лабораторії.


Автор: Наседкина А.К.