Імуноферментний аналіз (іфа, elisa). Суть, принцип методу та етапи дослідження. Аналіз на антитіла, класи антитіл, імунний комплекс.

У зв`язку з розвитком клітинних технологій, молекулярної біології, генетики, фізики, хімії та ряду інших високотехнологічних дисциплін в повсякденну практику впроваджуються нові високоточні і високотехнологічні методи. Дані міждисциплінарні тенденції зачіпають і область медичних знань, і суміжні галузі біологічних, біохімічних проблем. За останні десять років набув широкого поширення і впровадження в масову практику метод клінічної лабораторної діагностики під назвою імуноферментний аналіз.

Взагалі технології імунологічних ферментативних і радіологічних реакцій широко використовувалися в типування клітин, культур клітин, різних тканин з початку 80-х років XX століття. Однак методи ці були дуже трудомісткими, що не уніфікованими, що не стандартизованими, що виключало їх використання в лікувально-діагностичних цілях в масовому порядку. Такими методами користувалися лише вузькі, наукомісткі і високоспеціалізовані лабораторії.

Однак з розвитком техніки, мікротехніки, виробництва різних біополімерних матеріалів стало можливим виробляти готові набори імуноферментної діагностики, якими зможуть користуватися лабораторії лікувально-профілактичних закладів. ІФА широко використовується для діагностики різноманітних інфекцій (хламідіоз, сифіліс, цитомегаловірус, токсоплазмоз, герпес і т.д.), як гострих, так і хронічних, а також прихованих форм, які протікають без клінічних сімптомов.Также цей метод застосовують для контролю над хронічними захворюваннями. Давайте спробуємо розібратися, що це за метод, і які принципи лежать в його основі?

Компоненти імуноферментного аналізу - імунна реакція і ферментативна реакція

Імуноферментний аналіз, як видно з назви, складається з двох різних компонентів - імунної реакції і ферментативної реакції. Імунна реакція виробляє зв`язування біологічних молекул, елементів клітини або мікроорганізму, які власне і намагаються виявити, а ферментна реакція дозволяє побачити і виміряти результат імунологічної реакції. Тобто імунна реакція - це частина комплексної методики, яка власне виявляє шуканий мікроб. А ферментна реакція - це та частина комплексної методики, яка дозволяє перевести результат імунної реакції в форму, видиму оком, і доступну для вимірювання рутинними хімічними методиками. Виходячи з такої структури методу імуноферментного аналізу, розберемо обидві його частини.

Імунна реакція, що це? Що таке антитіло, антиген?

Що таке імунна реакція? Що таке антиген?
В першу чергу розберемо, що таке імунні реакції. імунні реакції - Це специфічні реакції зв`язування антигену з антитілом з утворенням імунного комплексу. Що це означає? На поверхні кожної клітини будь-якого організму є особливі структури, які називаються антигени. Антигени в цілому - це молекули, які несуть інформацію про клітці (подібно інформації на бейджі у людини, де вказуються основні дані цієї людини).

Індивідуальні та видові антигени - що це? Навіщо потрібні ці антигени?

є антигени індивідуальні, тобто притаманні лише даному конкретному організму. Ці індивідуальні антигени різні у всіх людей, є схожі один на одного, але все одно відрізняються. Двох однакових копій індивідуальних антигенів в природі не існує!

Другий основний тип антигенів - це видові антигени, тобто властиві будь-якого конкретного виду живих істот. Наприклад, у людини присутня свій видовий антиген, загальний для всіх людей, у мишей є свій мишачий видовий антиген і т.д. На поверхні кожної клітини обов`язково присутні видовий та індивідуальний антиген.

Видовий антиген використовують клітини імунної системи для розпізнавання «свій - чужий».

Як відбувається впізнавання антигену?

Імунна клітина зв`язується з підозрілою кліткою і проводить впізнання саме за індивідуальним антигену. У пам`яті імунної клітини «записано» як виглядає «свій антиген». Таким чином, якщо антиген підозрілої клітини співпадає з описом «свій антиген», значить, ця клітина власного організму і не є серйозним. Тоді імунна клітина «відв`язується» і йде. А якщо антиген не співпадає з описом «свій», тоді імунна клітина ідентифікує цю клітку як «чужий», а значить потенційно небезпечний для всього організму. В цьому випадку імунна клітина не «відв`язується», а починає знищувати небезпечний об`єкт. Точність такого імунологічного впізнавання вражає уяву - 99,97%. Помилок практично не буває!

Що таке антитіло, імунний комплекс?
А що являє собою антитіло?

Антитіло - це особлива молекула, розташована на поверхні імунної клітини. Саме антитіло і зв`язується з антигенами підозрілої клітини. Далі антитіло передає інформацію всередину клітини, де відбувається упізнання, і отримує зворотний сигнал двох видів «свій» або «чужий». При сигналі «свій» антитіло руйнує зв`язок з антигеном і відпускає клітку.

Що таке імунний комплекс?
При сигналі «чужий» ситуація розгортається інакше. Антитіло не розриває зв`язок з антигеном, а навпаки, посилаючи специфічні сигнали, викликає «підкріплення». Біологічно це означає, що інші антитіла, що знаходяться в іншій частині клітини, починають переміщатися до ділянки, звідки йде сигнал небезпеки, і також утворюють зв`язок між собою і спійманим антигеном. Зрештою, антиген виявляється, оточений з усіх боків і міцно прівязан.Такой комплекс антиген + антитіло називається імунний комплекс. З цього моменту починається утилізація антигену. Але зараз подробиці процесу нейтралізації антигену нас не цікавлять.

Види антитіл (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Антитіла - це білкові структури, які, відповідно, мають хімічну назву, яке і використовується як синонім слова антитіла. Отже, антитіла = імуноглобуліни.

Існують 5 типів імуноглобулінів (Ig), які зв`язуються з різними видами антигенів в різних місцях людського організму (наприклад, на шкірі, на слизових, в крові і т. д.). Тобто антитіла мають поділ праці. Ці імуноглобуліни називаються буквами латинського алфавіту - A, M, G, D, E і позначаються наступним чином - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

В діагностиці використовують тільки один вид антитіл, який найбільш специфічний щодо обумовленого мікроба. Тобто зв`язування даного виду антитіл з визначеним антигеном відбувається завжди. Найчастіше застосовуються IgG і IgM.

Саме цей принцип імунної реакції (унікальна точність і специфічність впізнавання визначається біологічного об`єкта) лежить в основі імуноферментного аналіза.В силу високої точності антитіл в впізнаванні антигенів, точність всього методу імуноферментного аналізу виявляється також високою.

ферментативна реакція

Яка реакція - ферментативна? Що таке спорідненість, субстрат і продукт реакції?
Перейдемо до розгляду ферментативної реакції в роботі методу імуноферментного аналізу.

Що таке ферментативна реакція?

ферментативна реакція - Це хімічна реакція, при якій одна речовина під дією ферменту перетворюється в інше. Речовина, на яке діє фермент, називається субстратом. А речовина, яке виходить в результаті впливу ферменту, називається продуктом реакції. Причому особливість ферментативної реакції така, що певний фермент діє тільки на певний субстрат. Така властивість ферменту дізнаватися «свій» субстрат називається спорідненістю.

Таким чином, кожен фермент проводить тільки одну, специфічну для нього реакцію. Ферментів в біологічному світі відомо безліч, так само як і ферментативних реакцій. У імуноферментної діагностики використовується лише кілька ферментативних реакцій - не більше 10. При цьому вибирали такі ферментативні реакції, продуктом яких є забарвлені речовини. Чому ж продукти ферментативної реакції повинні бути пофарбованими? Тому що для обчислення концентрації речовини по пофарбованому розчину існує простий хімічний метод - колориметрия.

Метод колориметрии - суть і принцип

Колориметрія застосовує вимір щільності забарвлення розчину, а по щільності забарвлення обчислюють концентрацію вещества.Прі цьому спеціальний прилад - колориметр вимірює щільність забарвлення розчину. В колориметрії можливі два варіанти залежності щільності забарвлення від концентрації речовини - це прямо пропорційна залежність або обернено пропорційна залежність. При прямо пропорційній залежності, чим вище концентрація речовини, тим інтенсивніше щільність забарвлення розчину. При обернено пропорційній залежності, чим вище концентрація речовини, тим нижче щільність забарвлення розчину. Технічно це відбувається так: береться кілька розчинів з відомою концентрацією речовини, вимірюється щільність цих розчинів, будується графік залежності концентрації від щільності забарвлення (калібрувальний графік).

Далі вимірюють щільність забарвлення розчину, концентрацію якого з`ясовують, і за калібрувальним графіком знаходять значення концентрації, що відповідає рівню виміряної щільності забарвлення раствора.В сучасних автоматичних колориметрах тільки один раз проводять калібрування, далі апарат сам будує калібровану криву, яка залишається в пам`яті приладу, і вимір відбувається автоматично.

У иммуноферментном аналізі найчастіше застосовуються наступні ферменти: пероксидаза, лужна фосфатаза, авидин.

Як же поєднуються імунологічна і ферментативна реакція в иммуноферментном аналізі? Зараз ми перейдемо до розгляду власне імуноферментного аналізу. Які етапи він включає і що відбувається при протіканні цих реакцій? Імуноферментний аналіз буває прямий і непрямий.

Прямий імуноферментний аналіз - етапи проведення

У прямому иммуноферментном аналізі використовують антитіла до виявляти антигену, з`єднані зі специфічною міткою. Ця специфічна мітка і є субстрат ферментативної реакції.

Прикріплення антигенів до поверхні лунки і з`єднання антигену з антитілом

Як проходить прямий імуноферментний аналіз? Береться біологічний матеріал (кров, зіскрібки зі слизових, мазки) та поміщається в спеціальні лунки. Біологічний матеріал залишають в лунках на 15-30 хвилин, щоб антигени могли приклеїтися до поверхні лунок. Далі в ці лунки додають антитіла до виявляти антигену. Це означає, що виявляючи антигени, наприклад, сифілісу, додаються антитіла проти антигенів сифілісу. Ці антитіла отримують промисловим способом, а лабораторії купують вже готові набори.Данную суміш досліджуваного матеріалу і антитіл залишають на деякий час (від 30 хвилин до 4-5 годин), щоб антитіла змогли знайти і зв`язатися з «своїм» антігеном.Чем більше в біологічній пробі антигенів, тим більше антитіл зв`яжеться з ними.

Видалення «зайвих» антитіл

Як було зазначено, антитіла до того ж пов`язані зі специфічною меткой.Поскольку антитіла додаються в надлишку, то не всі вони зв`яжуться з антигенами, а якщо антигену взагалі немає в пробі, то, відповідно, жодне антитіла не зв`яжеться з шуканим антигеном. Для того щоб прибрати «зайві» антитіла, вміст з лунок просто виливають. В результаті цього всі «зайві» антитіла прибираються, а залишаються ті, які зв`язалися з антигенами, оскільки антигени «приклеєні» до поверхні лунок. Лунки кілька разів обполіскують спеціальним розчином, який дозволяє вимити всі «зайві» антитіла.

Ферментативна реакція - утворення пофарбованого з`єднання

Далі починається другий етап - ферментативна реакція. У промиті лунки додають розчин з ферментом і залишають на 30-60 хвилин. Даний фермент має спорідненість до речовини (специфічної мітці), з яким пов`язані антитіла. Фермент проводить реакцію, в результаті якої ця специфічна мітка (субстрат) перетворюється в забарвлене речовина (продукт). Потім методом колориметрії знаходять концентрацію цього пофарбованого речовини. Оскільки дана специфічна мітка пов`язана з антитілами, значить, концентрація пофарбованого продукту реакції дорівнює концентрації антитіл. А концентрація антитіл дорівнює концентрації антигенів. Таким чином, в результаті проведеного аналізу ми отримуємо відповідь, яка концентрація виявляється мікроба або гормону.

Саме так проходить прямий імуноферментний аналіз. Однак сьогодні частіше використовують непрямий імуноферментний аналіз, оскільки чутливість і точність непрямого вище, ніж прямого. Отже, перейдемо до непрямого імуноферментного аналізу.

Непрямий імуноферментний аналіз - етапи проведення

У непрямому иммуноферментном аналізі два етапи. При проведенні першого етапу використовують немічених антитіла до виявляються антигенів, а в другому етапі застосовують мічені антитіла до перших немічених антитіл. Тобто виходить не пряме зв`язування антитіла з антигеном, а подвійний контроль: зв`язування антитіл з антигеном, після чого зв`язування друге антитіл з комплексом антитіло + антиген. Як правило, антитіла для першого етапу - мишачі, а для другого - козячі.

Фіксація антигенів на поверхні лунки і зв`язування антигену з немічених антитілом
Так само як і для прямого імуноферментного аналізу проводиться забір біологічного матеріалу - кров, зіскрібки, мазки. Досліджуваний біологічний матеріал вносять у лунки і залишають на 15-30 хвилин для приклеювання антигенів до поверхні лунок. Потім в лунки вносять немічених антитіла до антигенів і залишають на проміжок часу (1-5 годин), щоб антитіла зв`язалися зі «своїми» антигенами і утворили імунний комплекс (перший етап). Після чого видаляють «зайві», які не зв`язалися антитіла, шляхом виливання вмісту лунок. Проводять промивання спеціальним розчином для повного видалення всіх не зв`язалися антитіл.

Зв`язування міченого антитіла з комплексом антиген + немічених антитіло
Після чого беруть другі антитіла - мічені, додають в лунки і знову залишають на деякий час - 15-30 хвилин (другий етап). За цей час мічені антитіла зв`язуються з першими - НЕ міченими і утворюють комплекс - антитіло + антитіло + антиген. Однак і мічені, і не мічені антитіла вносяться в лунки в надлишку. Тому потрібно знову видалити «зайві», вже мічені антитіла, що не зв`язалися з немічених антитілами. Для цього повторюють процедуру виливання вмісту лунок і промивання спеціальним розчином.

Ферментативна реакція - утворення пофарбованого з`єднання
Після чого вносять фермент, який здійснює реакцію перетворення «мітки» в забарвлене речовина. Забарвлення розвивається протягом 5-30 хвилин. Потім проводять колориметрію і обчислюють концентрацію забарвленої речовини. Оскільки концентрація пофарбованого речовини дорівнює концентрації мічених антитіл, а концентрація мічених дорівнює концентрації немічених антитіл, яка, в свою чергу дорівнює концентрації антигену. Таким чином, отримуємо концентрацію виявляється антигену.
Такий подвійний контроль у вигляді використання двох видів антитіл дозволив підвищити чутливість і специфічність методу імуноферментного аналізу. Незважаючи на подовження часу проведення аналізу і включення додаткових етапів, ці втрати компенсуються точністю результату. Саме тому в даний час переважна більшість методик імуноферментного аналізу - це непрямий імуноферментний аналіз.

Які захворювання виявляють методом імуноферментної діагностики?

Перейдемо до розгляду того, які захворювання і які біологічно активні речовини виявляються методом імуноферментного аналізу. Речовини, які виявляються методом імуноферментного аналізу, представлені в таблиці.


У таблиці наведено далеко не повний перелік аналізів (тільки найбільш поширені), які виконуються за допомогою імуноферментного аналізу. Привести ж весь список не представляється можливим, оскільки він буде дуже великим і постійно поповнюється. Крім лабораторної діагностики метод імуноферментного аналізу широко використовується в наукових дослідженнях.




Автор: Наседкина А.К.